先天性巨结肠需要通过临床症状以及辅助检查进行诊断。

70%以上的先天性巨结肠在新生儿期就能明确诊断。其会表现为胎粪排出延迟，会伴有呕吐、腹胀，随后会频繁出现便秘、呕吐、腹胀、腹痛，偶尔也会出现腹泻症状。由于排便不畅会导致患儿营养不良，严重的有可能会引发结肠炎、肠穿孔。

腹部立位平片会表现为低位不全性肠梗阻、结肠扩张明显，钡灌造影相对比较准确。典型的表现有痉挛肠段、漏斗状肠段以及扩张肠段。通过直肠黏膜活检，如果神经节细胞缺失可明确诊断。