支原体肺炎需要与多种疾病进行鉴别。
在临床上，支原体肺炎首先要与细菌性肺炎相鉴别。细菌性肺炎起病往往更急骤，高热、咳脓性痰等症状较为常见，血常规检查白细胞总数和中性粒细胞比例通常显著升高，而支原体肺炎白细胞总数正常或稍高，以中性粒细胞为主，C-反应蛋白CRP在细菌性肺炎时多明显升高，支原体肺炎时CRP可正常或轻度升高。影像学上，细菌性肺炎多表现为大片炎症浸润阴影或实变影，在实变阴影中常可见透亮支气管影，即支气管充气征，而支原体肺炎肺部病变多为单侧下叶浸润，可从肺门附近向外伸展，呈云雾状浸润影。
同时，支原体肺炎还需与病毒性肺炎鉴别。病毒性肺炎多在冬春季节发病，全身症状如发热、头痛、全身酸痛等较为突出，咳嗽多为干咳，少痰。支原体肺炎咳嗽多为刺激性干咳，可伴有少量黏痰。从实验室检查来看，病毒性肺炎白细胞总数正常、稍高或偏低，淋巴细胞比例可升高，而支原体肺炎白细胞总数正常或稍高。在影像学方面，病毒性肺炎多为间质性改变，两肺纹理增粗、模糊，磨玻璃样阴影等，支原体肺炎的肺部影像学表现更为多样化，除了间质性改变外，还可有斑片状阴影等表现。支原体肺炎还需与肺结核等疾病进行鉴别，肺结核常有低热、盗汗、乏力、消瘦等结核中毒症状，咳嗽、咳痰可持续较长时间，部分患者可有咯血，痰中可找到结核菌，结核菌素试验、γ-干扰素释放试验等有助于鉴别诊断。
